AM上的材料人太会玩～一个自组装多肽，肿瘤靶向、免疫治疗和成像功能一个不少

研究背景

分子靶向治疗（Molecule-targeted therapy）是一种以特定分子为靶点的药物治疗癌症的方法，能够选择性抑制癌细胞而不伤害肿瘤组织部位的正常组织细胞，其抗癌效果优于常规化疗药物，该治疗方法又被称为“生物导弹”。目前，许多分子靶向的抗癌药物已经被开发用于癌症治疗，如表皮生长因子受体抑制剂等，然而这些传统的抑制剂很少涉及诱导癌症相关蛋白聚集。最新研究表明，这些癌症相关蛋白的聚集体在驱动细胞信号传导和将激活信息传递给细胞反应中起重要作用。因此，开发能够诱导癌症相关蛋白聚集的分子靶向抗癌药物具有广阔的发展前景。

由于冷肿瘤（Cold tumors）缺乏肿瘤浸润性T细胞，很难在治疗上诱导抗肿瘤免疫反应。因此，将冷肿瘤转化为免疫原性热肿瘤（Hot tumors）是一种有效的手段，因为免疫治疗对热肿瘤有很好的治疗效果。诱导癌细胞的免疫原性细胞死亡（Immunogenic cell death, ICD）是实现上述目标的有效策略，进行ICD的肿瘤细胞能够释放肿瘤抗原和损伤相关的分子模式（Damage associated molecular patterns, DAMPs），释放的DAMPs有助于免疫细胞将肿瘤抗原呈递给T细胞，增强T细胞的活化、增殖和浸润，实现冷肿瘤向热肿瘤的转化。然而，将分子靶向药物与肿瘤免疫原性冷热转换结合起来还有待研究。

工作介绍

为解决上述问题，近日南开大学丁丹教授课题组研制出了一种基于超分子自组装多肽的分子靶向抗癌剂（DBT-2FFGYSA），成功为分子靶向治疗与肿瘤免疫原性冷热转换之间架起了桥梁。

1.两个外周肽

FFGYSAYPDSVPMMS（FFGYSA）用于促进自组装和提高靶向能力。含有两个芳香苯丙氨酸（FF）的肽段序列能够有效提高肽段自组装性能，YSA能够靶向肿瘤过表达的EphA2蛋白受体，避免对正常细胞产生毒性。

2. 环境敏感的荧光分子4,7-di(thiophen-2-yl)-2,1,3-benzothiadiazole（DBT）用于产生荧光信号，水中的DBT-2FFGYSA不发光，当其与EphA2蛋白受体结合后开启明亮的荧光。

3. 优异的自组装能力和两个类似交联剂的“肽臂”能够增强蛋白质-蛋白质的相互作用，促进EphA2受体间的交叉磷酸化并诱导EphA2受体的大量聚集，从而有效抑制肿瘤细胞的增殖。

4. 不仅于此，DBT-2FFGYSA能够诱发肿瘤细胞ICD，成功将冷肿瘤转化为热肿瘤，增强了免疫治疗。

该工作发表在Advanced Materials上，IF=27.398。

研究思路

论文导读

 Figure 1. DBT-2FFGYSA 和DBT-2YSA的合成路线以及性能的表征

相较于DBT-2YSA，引入了两个自主装FF辅助基团的DBT-2FFGYSA具有更低的临界胶束浓度（Critical micelle concentrations, CMCs），更容易形成微型网络结构和类似丝状结构的聚集体（Figure 1b-c）。在四种缓冲液中DBT-2FFGYSA和DBT-2YSA几乎并没有荧光，当外部环境发生变化，极性比水小时，两者的荧光被点亮，有明显的放大效果（Figure 1d）。

Figure 2. DBT-2FFGYSA靶向EphA2蛋白受体能力的研究

以PC-3癌细胞为模型，DBT-2FFGYSA具有优异的靶向癌细胞过表达的EphA2蛋白受体的能力，其与EphA2蛋白受体结合后，能够点亮其荧光实现对EphA2蛋白受体特异性成像（Figure 2a）。与DBT-2YSA相比，在DBT-2FFGYSA孵育后的PC-3癌细胞中能观察到更大尺寸和更高亮度的荧光斑点（Figure 2 b-c），这也暗示了DBT-2FFGYSA可以诱导EphA2受体在癌细胞中的聚集。SMCs平滑肌细胞作为EphA2的阴性对照，无论是DBT-2FFGYSA还是DBT-2YSA与SMCs细胞孵育后均不能呈现出明亮的红色荧光（Figure 2 f-g），进一步证明了DBT-2FFGYSA对EphA2受体的特异性靶向能力。

 Figure 3. DBT-2FFGYSA抑制癌细胞的增殖

DBT-2FFGYSA和DBT-2YSA均未对SMCs平滑肌细胞产生毒性，而对于PC-3癌细胞，只有DBT-2FFGYSA展现出对癌细胞明显的杀伤效果（Figure 3a-b）。此外，BrdU掺入实验显示出相同的结果，DBT-2FFGYSA不仅可以有效抑制癌细胞的增殖（Figure 3c），并且在克隆形成试验中对PC-3癌细胞集落的形成也有明显的抑制作用（Figure 3d），然而即使高浓度的DBT-2FFGYSA也没有对通过siRNA转染实验敲除EphA2表达的PC-3癌细胞展现出明显的毒性（Figure 3e-g）。因此，DBT-2FFGYSA的细胞毒性植根于EphA2受体靶点，且自组装辅助基团FFG对EphA2受体的聚集起关键作用。

Figure 4. DBT-2FFGYSA促进EphA2受体间的交叉磷酸化

并引起EphA2受体的聚集，通过MAPK途径引起下游的细胞凋亡

DBT-2FFGYSA与EphA2受体之间的相互作用导致了超过二聚体的大聚集体的形成（Figure 4 b-g），可以为EphA2的受体提供更多的相互交叉磷酸化的机会，从而显著促进抗肿瘤信号通路的激活，实现对肿瘤的高效抑制。转录组学数据显示，DBT-2FFGYSA处理的PC-3癌细胞在转录水平上，Bcl-2、Caspase-3和CytC上调，而Erk1/2下调（Figure 4h），说明了DBT-2FFGYSA通过MAPK途径诱导PC-3癌细胞凋亡。Western blot实验在蛋白水平上同样证明了该过程（Figure 4i）。

 Figure 5. 肿瘤模型小鼠的体内抗癌治疗

以PC-3肿瘤小鼠为模型，DBT-2FFGYSA具有优异的抗肿瘤活性，治疗16天肿瘤体积明显缩小，免疫组化分析同样证明了其抗肿瘤能力（Figure 5a-b），且该分子不会对小鼠产生毒性，小鼠体积并没有明显的减少（Figure 5c）。4T1乳腺肿瘤具有免疫冷微环境，易导致免疫治疗失败。在4T1肿瘤小鼠模型中，制备的DBT-2FFGYSA依旧展现出良好的抗肿瘤活性（Figure 5d-e），该治疗方法可导致肿瘤内CD8⁺ T细胞浸润增加，最终达到治疗效果。

 Figure 6. DBT-2FFGYSA将冷肿瘤转化为热肿瘤

DBT-2FFGYSA可诱发肿瘤ICD，增强T细胞的浸润，使得肿瘤从免疫冷坏境转变为热环境。在ICD过程中，钙网蛋白（Calreticulin, CRT）会转移到癌细胞的表面，暴露在癌细胞表面（ecto-CRT），是ICD的标志（Figure 6a）。CRT外翻不仅会使抗原呈递细胞（如树突状细胞）吞噬肿瘤细胞尸体，还能有效地促进树突状细胞的成熟和肿瘤抗原向T细胞的递呈，从而激发特异性T细胞介导的免疫应答。经治疗后的肿瘤组织中CD4⁺和CD8⁺ T细胞含量明显提高，其中CD38⁺、TNF-α⁺和IFN-γ⁺ CD8⁺ T细胞的含量增多，然而PD-1⁺ CD8⁺ T细胞比例明显降低（Figure 6b-c），佐证了DBT-2FFGYSA具有成功地将冷肿瘤转化为热肿瘤的能力。

论文亮点

1. 利用YSA肽靶向癌细胞过表达的EphA2蛋白受体，避免与正常细胞的结合，实现精确癌症治疗。

2. 环境敏感的DBT荧光团会在DBT-2FFGYSA与EphA2蛋白受体结合后点亮其荧光，实现对EphA2蛋白受体的特异性成像。

3. FFG肽作为交联剂的“肽臂”，其优异的自组装能力可以使EphA2蛋白受体聚集，诱发癌细胞的凋亡。

4. 同时，DBT-2FFGYSA可通过诱导肿瘤细胞ICD，招募大量浸润肿瘤的T细胞，有效地将冷肿瘤转化为热肿瘤，提高免疫治疗效果。为分子靶向治疗和肿瘤免疫原性冷热转换架起桥梁。

文献链接

Jun Li, Yuan Fang, Yufan Zhang, Huaimin Wang, Zhimou Yang, and Dan Ding*

Supramolecular Self-Assembly-Facilitated Aggregation of Tumor-Specific Transmembrane Receptors for Signaling Activation and Converting Immunologically Cold to Hot Tumors, Adv. Mater., 2021, 2008518. DOI: 10.1002/adma.202008518

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